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免疫熒光（Immunofluorescence， IF）染色是一種廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究和臨床診斷的技術(shù)。IF利用熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)特異性靶抗原。染色成像非常直觀，可以直接觀察結(jié)果。雖然這是一個(gè)成熟的技術(shù)，但必須考慮多個(gè)因素，并采取各種優(yōu)化步驟，以確保染色成功。

實(shí)驗(yàn)步驟：

培養(yǎng)細(xì)胞的免疫染色

除非另有說(shuō)明，所有步驟均在室溫下進(jìn)行。為了獲得最佳染色效果，除非使用的細(xì)胞系很脆弱（例如神經(jīng)元細(xì)胞），否則應(yīng)在緩慢移動(dòng)的旋轉(zhuǎn)搖床上進(jìn)行操作。

一、固定和通透：

吸取培養(yǎng)基，用1X PBS（Cat No. PR20023）清洗接種在干凈蓋玻片上的細(xì)胞。

用新鮮的4%多聚甲醛在1X PBS中固定細(xì)胞15分鐘。

用1X PBS沖洗蓋玻片3次，每次3分鐘。 

在1X PBS中用0.2%Triton X-100滲透5分鐘。

用1X PBS沖洗蓋玻片3次，每次3分鐘。

二、封閉：

在1X PBS中制備5%正常血清的封閉溶液。從產(chǎn)生第二抗體的同一物種中選擇血清，例如，如果第二抗體是山羊抗小鼠，則應(yīng)選擇山羊血清作為封閉液。

將細(xì)胞與封閉溶液孵育1小時(shí)（或者，如果沒(méi)有相應(yīng)的血清，則使用1X PBS中的3%BSA進(jìn)行封閉。）

三、抗體孵育：

吸取封閉液，在抗體稀釋緩沖液中稀釋一抗。設(shè)置空白對(duì)照（在不加一抗的抗體稀釋緩沖液中培養(yǎng)）。常溫孵育1小時(shí)，或者，在4°C的溫度下孵育過(guò)夜.

請(qǐng)注意：如果隔夜孵育，請(qǐng)采取措施確保蓋玻片不會(huì)變干。

用1X PBST（Cat No. PR20024，含0.1%Tween）清洗樣本3次，每次5分鐘。

加入用抗體稀釋緩沖液稀釋的適量的熒光二抗，并在潮濕、黑暗的環(huán)境中室溫孵育1小時(shí)。

請(qǐng)注意：加入熒光二抗后，實(shí)驗(yàn)樣本必須盡可能保持在黑暗條件下。

用1X PBST（0.1%Tween）清洗樣本3次，每次5分鐘。

四、封片和鏡檢：

用含DAPI（如果需要）的封片劑將樣本封固在載玻片上。

在熒光顯微鏡下檢查載玻片。